1990年, Tuerk等报道了一种新的体外筛选与PCR扩增相结合的组合化学技术,从人工构建的随机寡核苷酸文库中筛选到能特异性结合噬菌体T4 DNA聚合酶的寡核苷酸配体。同年, Ellington等也采用同样的技术筛选到有机染料的寡核苷酸配体。因这种组合化学技术的原理是基于进化机制——变异、选择、复制,因此命名为“指数富集的配体系统进化”(SELEX)技术,所筛选出的靶物质寡核苷酸配体称为适配子(aptamer) 。适配子与靶物质结合的特异性和亲和力可与抗体媲美,甚至优于抗体,加上其技术上和稳定性方面的优势,近10多年来,采用SELEX技术筛选核酸适配子不断被应用于生命科学各个领域的研究工作中,包括对疾病的诊断与治疗。本文对SELEX技术及核酸适配子在疾病诊断中的应用前景作一综述。
1 SELEX技术及适配子
1.1 SELEX技术的基本原理
预先设计并合成单链寡核苷酸( ssDNA)文库。寡核苷酸的两端为固定序列,中间为随机序列。将靶物质与ssDNA文库混合,其中能与靶物质特异性结合的ssDNA形成靶2ssDNA复合物,分离该复合物并洗脱ssDNA,将后者作为模板进行PCR扩增,制备下一轮筛选的ssDNA文库。通过重复筛选与扩增,与靶物质高亲和力特异性结合的ssDNA从文库中分离出来,其纯度随SELEX过程的进行而不断增高,最后占据库容量的90%以上。如果在每一个SELEX循环末都加上RNA 反转录步骤,则可筛选到RNA适配子。一般经过8～20个循环,即可完成筛选过程。将筛选到的核酸适配子文库进行克隆、测序和鉴定,其中特异性强、亲和力高的适配子即可用于靶物质的分子识别研究。
1.2 核酸适配子的特点
1.2.1 靶分子广:寡核苷酸随机区的每个核苷酸种类都存在4种可能性(A、C、G或T) ,如果随机区有n个核苷酸,那么随机序列的多样性有4*n 种。随机区域长度为30个核苷酸左右,文库的容量能达到10*14-15。另一方面,单链寡核苷酸的一个独特表现是容易形成各种形状的二级结构和三级结构,如发夹、口袋、假结、凸环、G-四聚体等空间结构。文库中核苷酸随机序列的多样性决定了寡核苷酸立体构象的多样性,巨大的库容所蕴含的丰富的核苷酸立体构象可与自然界存在的几乎所有种类的分子发生作用。适配子与靶分子通过氢键、范德华力等与靶分子相互作用,或嵌合,或包被,形成稳定的复合物。目前, SELEX技术筛选所用的靶分子包括:与基因调控有关的核酸结合蛋白(如HIV-1 Rev蛋白) , 非核酸结合蛋白(如凝血酶) ,小分子有机物(如ATP) ,甚至金属离子、多糖、有机染料,以及完整的细胞、病毒、孢子等。因此,与其他文库筛选技术相比, SELEX技术适应范围更加广泛。
1.2.2 高特异性和高亲和力:核酸适配子只识别与其互补的分子空间结构,能够分辨出靶分子结构上的细微差别,比如相差一个甲基或一个羟基,或D /L镜像体之间的区别等。同时核酸适配子与靶分子结合的解离常数( Kd)可以达到纳摩尔,甚至皮摩尔水平,具有比抗体或其他类型配基更高的亲和力和特异性,有的甚至高于天然配体,几乎可以完全避免非特异性结合。如茶碱与其他黄嘌呤类似物咖啡因、可可碱的结构非常相似,常规的茶碱单抗与后两者有交叉反应,而核酸适配子只特异结合茶碱,与其他两种物质无反应,且与茶碱的亲和力比与咖啡因高10000倍。Wang等用消减SELEX能将已分化的PC12 细胞从正常(未分化的) PC12细胞中区分出来。
1.3 SELEX技术的完善及适配子的优化
1.3.1 SELEX技术的完善:近年来SELEX技术有了很大的发展,可以满足不同的筛选目的。复合靶SELEX (complex targets SELEX)以多种分子构成混合靶标,可同时筛选出多种靶分子的适配子而不互相干扰。混合SELEX ( blended SELEX)将已知占据靶分子非目的靶位的小分子掺入SELEX筛选体系中,来获得只与目的靶位结合、高度专一的适配子。随着对蛋白质与核酸相互作用研究的深入,出现了基因组SELEX ( genomic SELEX) ,可以更快更好地发现新的蛋白结合位点以及研究蛋白与核酸间的复杂调控网络。消减SELEX (subtractive SELEX)可将与两个复合靶中非目的相同靶分子作用的寡核苷酸先行去除,提高筛选效率,迅速获得特异的适配子。此外,还有光敏SELEX(photo SELEX)、定制SELEX (tailored SELEX)、体内SELEX(invivo SELEX)、表达盒SELEX(expression cassette SELEX)、进化模拟法SELEX (evolutionmimicking algorithm SELEX)、亲和层析SELEX、毛细管电泳SELEX等。
1.3.2 适配子的优化: 通过后SELEX 技术( Post2SELEX)的深入研究,目前已有多种方法对适配子进行优化,以增加其抗核酸酶能力,或使其更加稳定。如镜像异构适配子( Spiegelmerap tamer)以L2核糖代替D2核糖合成寡核苷酸,抗核酸酶的能力明显增强。对核苷酸进行化学修饰(如糖基化、硫代等),或将适配子联接到大分子载体上,可使其血浆中的存留时间更长。引入锁核酸(locked nucleic acid)的杂合DNA适配子也明显增强了抗核酸酶的能力。环状DNA适配子在血清或血浆中的半衰期超过10h。
2 适配子在疾病诊断中的应用前景
核酸适配子与靶物质结合所呈现的高敏感性和高特异性,使其在疾病诊断中具有良好的应用前景,尽管目前成熟的临床应用报道很少,但应用适配子检测靶蛋白的研究却不断增多,基于适配子的检测新技术也不断出现。
2.1 适配子应用于分子识别诊断优于抗体抗体是目前进行分子识别的主要物质,广泛应用于人类疾病的诊断。核酸适配子在亲和力和特异性方面可与抗体媲美,甚至优于抗体,并且具有抗体所不具备的其他一些优点: ①适配子通过体外筛选过程进化,不依靠动物、细胞及内环境,毒素和毒素结合位点也可作为靶标;②适配子没有免疫原性,可用于体内诊断或治疗; ③适配子的变性是可逆的,变性的适配子可在数分钟内再生,因而可反复使用; ④适配子稳定性好,可长期保存,能在常温下运输; ⑤适配子筛选周期更短,筛选过程已经自动化,能应用于大规模的工业生产; ⑥化学合成的适配子精确度高,重复性强,生产中很少存在批次间的差异; ⑦报告子如荧光素或生物素等可与适配子精确地结合在操作者能识别的位点上; ⑧适配子作用的靶分子范围更广,结合力更强; ⑨比抗体的分子小,可用于细胞内诊断和治疗; ⑩靶物质的免疫原性强弱不影响其适配子的筛选。
2.2 基于适配子的靶物质检测模式
2.2.1 三明治夹心法:基于抗体的诊断模式中以双抗体夹心法最为常用,采用核酸适配子检测靶物质时也可使用于这种模式。Ikebukuro等使用两种作用于凝血酶不同靶位的核酸适配子,一种用作捕捉分子,另一种用作检测分子,以“三明治”夹心方式构建化学生物传感器,成功地建立起凝血酶的检测新方法,其最低检出水平为10 nMol,在20～400 nMol之间呈良好的线性关系。
2.2.2 生物芯片:核酸适配子也可用于制作生物芯片, 建立高通量的检测技术。McCauley等以核酸适配子制成生物芯片,能同时、定量、特异地检出3种混于血清和细胞提取物中肿瘤相关蛋白(次黄嘌呤单磷酸脱氢酶Ⅱ、血管内皮生长因子和碱性成纤维生长因子),显示出良好的特异性和应用前景。
2.2.3 生物传感器:生物传感器是将生物活性材料(酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜等)与物理化学换能器有机结合,是物质分子水平的快速、微量分析方法。Minunni等建立起HIV21 Tat蛋白的核酸适配子传感器(aptasensor)检测系统,他们以压电石英晶体为换能器,将链霉卵白素预先沉积于电极表面,使生物素化适配子固定于电极表面,当Tat蛋白与适配子结合时,呈现出信号改变。Bang等以针对凝血酶的核酸适配子为例建立起电化学生物传感器检测系统,检出凝血酶的最低水平为11 nMol。
2.2.4 适配子信标:适配子信标在原理上类似分子信标。分子信标是近年来新型的定性和定量基因诊断方法,具有灵敏、特异、易于自动化等特点。Hamaguchi等报道,对凝血酶的适配子进行改造,使其5′端与3′端互补,两端分别标记荧光基团和淬灭集团,当存在凝血酶时,适配子构象发生变化,使荧光基团和淬灭基团分开,发出荧光信号,否则无荧光信号。Vicens等还证实适配子用于检测靶蛋白时能出现荧光谐振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET),类似FRET探针,能检测出极微量的血小板生长因子( PDGF)。
2.2.5 结构开关信号适配子: Nutiu等提出一种“结构开关信号适配子”(structure-switching signaling aptamers)概念,其思路是适配子的5′端标记荧光基团,另外设计一互补的寡核苷酸序列的3′端标记荧光淬灭剂,两者混合后互补结合成双链DNA而不发射荧光信号,当存在靶物质时,双链DNA解链,使荧光基团离开淬灭剂而发出荧光信号。
3 结 语
SELEX技术自问世以来,技术上不断丰富和完善,应用领域不断拓展。在适配子的修饰方面也有了不少进展,使适配子的稳定性得到提高。同时,应用适配子检测靶物质的模式也不断增多。可以预见,核酸适配子将逐渐在临床诊断中得到应用,特别在弥补抗体作为识别分子的不足方面发挥重要作用。 |
